Extracto
Las mutaciones en el
TP53
gen son las alteraciones más comunes en los tumores humanos.
TP53
los patrones de mutaciones a veces se han relacionado con la exposición carcinógeno. En el carcinoma hepatocelular, un G & gt específica; T transversión en el codón 249 se describe clásicamente como una huella dactilar de la aflatoxina B de exposición
1. Asimismo G & gt; transversiones T en los codones 157 y 158 se han relacionado con la exposición al tabaco en los cánceres de pulmón humanos. Sin embargo, siguen siendo polémicas acerca de la interpretación de los
TP53
patrón de mutación en los tumores como la huella digital de la exposición genotoxin. Mediante el uso de un ensayo funcional, el análisis funcional de los alelos separados en la levadura (FASAY), el presente estudio representa el patrón mutacional de
TP53 Hoteles en fibroblastos humanos normales después de
in vitro
exposición al bienestar carcinógenos conocidos: benzo
[a] pireno
, la aflatoxina B
1 y acetaldehído. Estos
in vitro
patrones de mutaciones fueron comparados con los encontrados en tumores humanos mediante el uso de la base de datos de la IARC
TP53
mutaciones. Los resultados muestran que la
TP53
los patrones de mutaciones encontradas en los tumores humanos pueden atribuirse sólo en parte a genotoxina exposición. Una compleja interacción entre el impacto funcional de las mutaciones en el fenotipo p53 y la historia natural del cáncer puede afectar a estos patrones. Sin embargo, nuestros resultados apoyan firmemente que la exposición genotoxinas juega un papel importante en la etiología de los cánceres considerados
Visto:. Paget V, Lechevrel M, André V, Le Goff J, D Pottier, Billet S, et al . (2012) Benzo
[a] pireno
, Aflatoxina B
1 y acetaldehído mutacional Patrones en
TP53
génica utilizando un ensayo funcional: Etiología relevancia para el cáncer humano. PLoS ONE 7 (2): e30921. doi: 10.1371 /journal.pone.0030921
Editor: Andy T. Y. Lau, Universidad de Shantou Medical College, China
Recibido: 26 Agosto, 2011; Aceptado: December 26, 2011; Publicado: 3 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Paget et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Agencia francesa de seguridad sanitaria de l'Environnement et du Travail (AFSSET; Convenio n ° EST-2007-48), el Ministerio de la Enseñanza Superior y de la Investigación (Convenio N ° 16.848 a 2.005), la región Norte-Paso de Calais (Convenio n ° 08070005) y la Ligue Nationale Contre le cáncer, Comité de l'Orne. Los Unité de Chimie et environnementale Interacciones sur le Vivant (UCEIV EA-4492) trabaja en colaboración con el Instituto de Investigaciones en environnement Industriel (Ireni), financiado por la Región Norte-Paso de Calais, el Ministerio de la Enseñanza Superior et de la Recherche, y Fondos europeos (FEDER). V.P. recibió una beca post-doctoral de la región Norte-Paso de Calais. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las mutaciones somáticas son un acontecimiento clave en la carcinogénesis y la actualidad se reconoce que la carcinogénesis involucra factores genéticos hereditarios, así como cambios epigenéticos. El punto de inflexión durante la iniciación del cáncer es la adquisición de mutaciones somáticas específicas que confieren a las células una ventaja selectiva para la proliferación clonal. Entre los muchos genes diferentes que participan en este proceso,
TP53
sigue siendo el más frecuentemente mutado en los cánceres humanos, representando más del 70% de todas las mutaciones descritas hasta ahora en los cánceres humanos [1]. La Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer (IARC)
TP53
base de datos contiene la mutación somática 27.580
TP53
mutaciones (http://www-p53.iarc.fr/, R15 liberación) [2] . A diferencia de otros genes supresores de tumores, la gran mayoría de
TP53
mutaciones son de sentido erróneo en lugar de mutaciones no sentido o de desplazamiento del marco, que conduce a varios patrones en diferentes tipos de cáncer. Curiosamente, estos patrones han sido a veces relacionado con la exposición de los factores etiológicos, tales como luz UV en el carcinoma de la piel [3], el tabaco en los cánceres de pulmón [4], la aflatoxina B [5] o ácido
1 en el hepatocarcinoma aristolóquico en el carcinoma renal [ ,,,0],6], [7]. Sin embargo, la interpretación de
TP53
patrón mutacional en los tumores como una huella digital de la exposición genotoxina sigue siendo controvertida [8]. De hecho, las mutaciones que resultan de la exposición a genotoxinas y otros eventos celulares que surgen durante la carcinogénesis afectan el perfil mutacional última encontrado en tumores humanos, por ejemplo, la selección clonal de mutantes particulares, la inestabilidad genética en las células cancerosas o influencias epigenéticas (por ejemplo, el estado de metilación) [9] - [11]
Como muchos
TP53
mutaciones encontradas en los tumores p53 afectan en gran medida. propiedades funcionales [12], un ensayo funcional, el análisis funcional de los alelos separados en la levadura (FASAY) aparece como una técnica útil para distinguir entre mutaciones silenciosas en
TP53
y los que hacen que la proteína inactiva [13], [14]. ADN de una variedad de fuentes pueden ser examinados por FASAY la presencia de un TP53
alelo que codifica una proteína disfuncional. Hemos descrito previamente los patrones de mutaciones en fibroblastos humanos normales después de
in vitro
exposición al acetaldehído y la aflatoxina B
1 (AFB
1) mediante el uso de FASAY [15], [16]. Aquí, hemos completado estos datos con los obtenidos con un genotoxin conocido: benzo
[a] pireno
(B
[a] P
). La exposición a B
[a] P y
AFB
1 da como resultado la formación de aductos voluminosos predominantemente dirigidos guanina. Vamos a discutir cómo estos pueden conducir a funcionalmente diferentes patrones de mutaciones en diferentes tumores.
Además, la forma experimental generada por
TP53
los patrones de mutaciones se compararon con los de los tumores relacionados registrados en la base de la IARC [ ,,,0],2]. El patrón mutacional de B
[a] P
se comparó con los de los cánceres de pulmón y discutido a fondo en el presente documento. Esto nos permitió analizar la causalidad de la exposición genotoxinas a los patrones de mutaciones de cáncer humano.
Materiales y Métodos
línea celular y cultivo celular
fibroblastos diploides humanos AG1521 (Instituto Coriell , Camden, NJ) fueron escogidos para este estudio. Ausencia de mutaciones preexistentes en
TP53
locus en estas células se confirmó por secuenciación de ADN genómico con un Beckman Automated Sequencer (CEQ 8000). Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 95% de aire, en medio esencial mínimo (MEM) de Eagle suplementado con suero bovino fetal inactivado al 10% (FBS). Antes de la exposición a la genotoxina, el medio se completó con 200 l (4%) de S9 fracción microsomal del hígado de ratas phenobarbital- y tratada naphtoflavone-(Biopredic, Rennes, Francia), NADPH (4 M) y G6P (5 mM). La cantidad necesaria de B
[a] (número Sigma, CAS: 50-32-8, hasta 200 M)
P se diluyó en el medio anterior y se utiliza para tratar las células durante 2 horas a 37 ° C . Posterior a la exposición, las placas de cultivo se lavaron tres veces con PBS y se incubaron en medio fresco. A medida que el tiempo de duplicación de estas células es de alrededor de 3 días, período de incubación de una semana desde fue elegido para permitir dos ciclos celulares y asegurar la fijación de mutaciones.
citotoxicidad estudio
fibroblastos AG1521 fueron expuestos a B
[a] P
a concentraciones de 1 a 200 mM en presencia de S9, por 2 horas a 37 ° C en 96 pocillos de micro-placas. Las placas se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 3 días a 37 ° C. La citotoxicidad se evaluó con un ensayo XTT (Sigma) según el protocolo Scudiero [17].
Post-etiquetado
método Post-etiquetado fue adaptado de Reddy y Randerath [18]. El ADN genómico fue extraído utilizando el método de fenol /cloroformo después del tratamiento clásico por ARNasa A y T1 seguido de proteinasa K (Sigma-Aldrich) y el ensayo post-etiquetado continuación, se llevó a cabo como se describe anteriormente [19]. A partir de los autorradiogramas obtenidos de este modo, los puntos correspondientes a los aductos se cortaron para medir la radiactividad. Los resultados se expresan como niveles de aductos relativos (RAL) calculados como sigue: RAL = (cpm
aductos /cpm
BPDE) x 110,7 x 10
-8, en la que CPM
aductos y CPM
BPDE corresponden a cuentas por minuto de las manchas eliminadas y del control positivo emitido a partir de timo de ternera expuesto a B
[a] P
-7,8-dihidrodiol-9,10-epóxido (BPDE), y llevando 110,7 aductos de 10
-8 nucleótidos normales, según lo determinado en otra parte [20]. El control positivo fue suministrado amablemente por F. Beland, Jefferson, EE.UU..
FASAY
La extracción de RNA y transcripción reversa (RT)-PCR se realizaron como se describe anteriormente [15]. Para amplificar los cebadores de cDNA que contienen un enlace fosforotioato en el extremo 3 'fueron diseñados: P3 [5'-ATT-TGA-TGC-TGT-CCC-CGG-ACG-ATA-TTG-AA (s) C-3'] y P4 [5'-ACC-CTT-TTT-GGA-CTT-CAG-GTG-GCT-GGA-GT (s) G-3 ']. FASAY se realiza de acuerdo con Flaman
et al.
[14], con algunas modificaciones, como se describe anteriormente [15]. PSS16 plásmido y la cepa de levadura YIG397 fueron donados generosamente por JM Flaman (INSERM U614, Rouen, Francia) y J. calabozo (LEMA EA3222, Le Havre, Francia), respectivamente
TP53.
- plásmidos que expresan fueron rescatados de colonias de color rojo aisladas, los cuales fueron devueltos a la cultura y se lisaron con
zimoliasa gratis (MP-Biomedicals). Purelink plásmido Miniprep rápida Kit® (Invitrogen) se utilizó para rescatar a los plásmidos. Antes de la secuenciación,
TP53
ADNc fue re-amplificado con los cebadores P5 [5'-TCT-CGC-ACT-TGC-ACG-TAC-TCC-3 '] y P6 [5'-AGA-GGA-GCT -GGT-GTT-GTT-GG-3 '], diseñado para cubrir el exón 4-9 según la secuencia descrita en GenBank (NM_000546). Dos conjuntos de cebadores fueron elegidos para secuenciar los sitios de recombinación en cada lado de la
TP53
cDNA: 5 'en cebadores de la región PA [5'-CAG-TCA-GAT-CCT-AGC-GTC-GAG-3 '] y PB [5'-CTC-CGT-CAT-GTG-CTG-TGA-CT-3']; en el 3 'cebadores de la región de PC [5'-AAG-GAA-TCA-TGC-GTG-TGG-AG-3'] y PD [5'-CAG-CCG-CTT-CTG-TCT-TGAAC-3 '].
herramientas de análisis de secuencia
se utilizó la base de datos de Thierry Soussi (http://p53.free.fr/) una referencia para el
TP53
secuencia de tipo salvaje y la base de datos de la IARC se utilizó la liberación R14 (http://www-p53.iarc.fr/) para comparar diferentes
TP53
los patrones de mutaciones [2]. BLAST herramienta de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se utilizó para el análisis de las similitudes de secuencia.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software SAS liberar 9.2. Se aplicó una prueba de chi cuadrado con un grado de libertad para evaluar la correspondencia entre las frecuencias observadas y teóricas de las mutaciones de las sustituciones de bases en los exones 4 a 9. Las comparaciones entre los patrones de sustituciones correspondientes a las genotoxinas se realizaron utilizando la prueba exacta de Fisher . Todas las pruebas fueron de dos caras con un nivel de significación de 0,05.
Resultados
estudios de citotoxicidad sobre fibroblastos AG1521
El crecimiento celular después de 2 horas de exposición de fibroblastos humanos AG1521 a B
[a] P
a diversas concentraciones mostró una citotoxicidad moderada de B
[a] P
en estas condiciones, la IC50 se estimó en más de 200 mu M (Figura 1). luego eligió concentraciones de exposición que varía de 1 M correspondiente a la concentración más alta sin ninguna inhibición de crecimiento a 50 micras que corresponden a una inhibición del crecimiento de 25%. Por lo tanto, el daño celular se redujo al mínimo y la reanudación de la cultura fue más fácil después de la exposición. El intervalo de concentraciones de acetaldehído y AFB
1 usado se describe y se ha descrito anteriormente [15], [16]. El acetaldehído se utilizó a 0,1 a 7,5 mM y AFB
1 en 16 a 800 nM.
La citotoxicidad de B
[a] P para
fibroblastsAG1521 humanos después de la recuperación 2 h de exposición y 3 días (4 pocillos por concentración, medias y desviaciones estándar).
Publicar etiquetado de B
[a] P
aductos de ADN inducida
la figura 2A muestra el patrón de ADN aductos voluminosos después de 2 horas de exposición a B
[a]
P 1, 10 y 50 M en presencia de la fracción de metabolización exógeno (S9mix). Control positivo se obtuvo a partir de ADN de timo de ternera desnudo expuesto a 35 nM BPDE, el metabolito activo (Figura 2B). Un punto importante de migrar de manera similar en las placas de cromatografía en capa fina fue visible en las cuatro muestras. Después de B
[a]
de exposición P, un segundo, pero muy tenue mancha también se observó para las 2 concentraciones más altas. El RAL en el ADN de B
[a] P
células expuestas después de la metabolización exógeno fueron significativamente por encima del límite de cuantificación de 1,75 × 10
-8. Se determinó este valor después de un proceso interno de validación (datos no publicados). Esto demuestra la eficacia del procedimiento de metabolización. Sin embargo, un efecto meseta se alcanza a los 10 M.
células (A) AG1521 después de 2 horas de exposición a B
[a] P.
(B) ADN de timo de ternera después de la exposición a 35 nM B (a) P-7,8-dihidrodiol-9,10-epóxido (control BPDE). RAL valores son la media de dos ensayos independientes.
Las tasas de mutación en FASAY
La Tabla 1 muestra los resultados globales de la B
[a] P.
Cada concentración se ensayó por triplicado. A medida que la reproducibilidad entre los triplicados fue muy alta, se muestra el número total de colonias para cada concentración.
Entre las colonias rojas que surgen de las células de control no tratadas, sólo unas pocas mutaciones de osos en la parte central de
TP53
, es decir, los exones 4 a 9. las otras colonias rojas fueron considerados como artefactos, ya que llevan plásmido sin digerir pSS16 o mutaciones localizadas en los sitios de recombinación. Entre las 3 colonias de color rojo a partir de células de control que llevan una mutación en la parte central de
TP53
, 2 mostraron una inserción AGT en el exón 7/8 que es probable que un defecto de empalme en vez de un verdadero evento mutacional, como se describió anteriormente [15]. Es de destacar que la tasa de este defecto de empalme fue comparable entre los experimentos en los tres genotoxinas discutidos aquí. Sólo un cierto mutación se encontró en las células de control, lo que permite el cálculo de una tasa de mutación espontánea de 0,05%. Esta tasa fue de alrededor de 9 a 18 veces menor que las tasas de mutación calculados en las células expuestas. Esta única mutación espontánea, era una G & gt; A de transición dentro de una secuencia CpG en el codón 267 (CGG & gt; TGG). Este tipo de mutación se atribuye clásicamente a la desaminación espontánea de 5-metilcitosina, aunque no podemos excluir la posibilidad de un error introducido por la ADN polimerasa durante la etapa de RT-PCR
.
Las tasas de mutación en las células expuestas estaban compuestas entre 0,45 a 0,92%. Según se observó con los datos post-etiquetado, se alcanza una meseta a 10 mM.
Identificación de
TP53
mutaciones en B
[a] P
fibroblastos humanos expuestos AG1521
la Tabla 2 muestra las 37 mutaciones verdaderas se encuentran en B
[a] P
células expuestas. Cinco mutaciones fueron de uno o más de base de inserciones /deleciones, dando lugar a un desplazamiento del marco. Las mutaciones restantes fueron sustituciones de nucleótido único de los cuales 1 sin sentido y 25 mutaciones sin sentido. El patrón mutacional se representa en la Figura 3C: G & gt; T transversiones son los más prevalentes (8/37, 21,6%). Ellos son seguidos por G & gt; A, G & gt; A en CpG y A & gt; transiciones G (7/37, 18,9% para cada una de ellas), deleciones (4/37, 10,8%), G & gt; transversiones C (2/37 , 5,4%), A & gt; transversiones T (1/37, 2,7%) y una inserción de base (1/37, 2,7%). Este patrón mutacional se discute a continuación, en comparación con el obtenido previamente después de la exposición a los fibroblastos AG1521 acetaldehído (Figura 3A) y la aflatoxina B
1 (AFB
1, la figura 3B) [15], [16].
(A)
in vitro
acetaldehído-fibroblastos humanos expuestos AG1521 (FASAY) (n = 35 mutaciones, los datos de [15]), (B)
in vitro
AFB
1-fibroblastos humanos expuestos AG1521 (FASAY) (n = 37 mutaciones, los datos de [16]), (C)
in vitro sobre B
[a] P
fibroblastos humanos expuestos AG1521 (FASAY) (n = 37 mutaciones).
la localización de las mutaciones entre los
TP53
exones 4 a 9
la figura 4 muestra la localización de las mutaciones desde B
[a] P
(este estudio), AFB
1 y el acetaldehído [15], [16]. B
[a]
patrón P-muestra dos puntos calientes, los codones 248 y 127, mientras que AFB
1 puntos calientes son los codones 179 y 220 y los acetaldehído codones 248, 245 y 283.
patrón mutacional como se ve en los fibroblastos AG1521 después de que B
[a] P
(barras de color naranja, n = 32 mutaciones); AFB
1 (barras de color rosa, n = 29 mutaciones); y acetaldehído (barras azules, n = 32 mutaciones) de exposición. Codones escritos en cursiva son inherentes a los puntos calientes en los tumores humanos de acuerdo con la base de datos de la IARC.
Con el fin de evaluar si el patrón de B
[a] P
mutaciones podría ser una cuestión de azar, se analizaron los datos según lo descrito por Shen
et al.
[21]. Para este análisis de los puntos calientes, sólo sustituciones de bases que se producen en los exones 5 al 9 fueron tomadas en cuenta. Los puntos calientes se definieron como las 24 mutaciones que representan el 50% de las mutaciones descritas en el cáncer de pulmón en la base de datos R14 IARC. En orden decreciente de frecuencia, estos son codones: 273, 248, 249, 245, 158, 157, 175, 179, 282, 220, 242, 163, 176, 154, 280, 266, 298, 237, 193, 281, 159, 135, 234 y 244. Si se supone estos 24 puntos calientes a mutar al azar, entonces ellos pueden predecir a ser golpeado 24/205 (número total de codones en los exones 5 a 9), es decir, a una frecuencia de 11,7 %. De las 30 sustituciones de bases en los exones 5 a 9 en nuestro estudio, 11 (36,7%) corresponden a uno de los puntos identificados anteriormente para los cánceres de pulmón, una tasa significativamente más alta que la prevista para los acontecimientos al azar (11,7%; p = 2,10
-5). El mismo análisis se realizó utilizando ya sea sólo puntos calientes que se encuentran en el cáncer de pulmón de los fumadores, o otra definición de hot-spots, es decir, la frecuencia de mutación superiores al 2% de todas las mutaciones en la forma propuesta por Olivier
et al.
[ ,,,0],22]. Estos análisis fueron altamente significativas sean cuales sean los parámetros utilizados (datos no mostrados).
Estas observaciones, junto con la comparación de los sitios de mutación con cáncer de pulmón puntos calientes como se muestra arriba, sostienen firmemente en contra de una distribución aleatoria de mutaciones en nuestro ensayo
Discusión
abordará dos cuestiones importantes:. en primer lugar, se generan perfiles de mutación experimental representativo de los que se producen de forma natural para un genotoxin dado? En segundo lugar, sobre la base de una recopilación de datos experimentales y epidemiológicos sobre las mutaciones asociadas a tumores humanos, puede mutaciones de
TP53
en sitios específicos químicamente inducida (codones) ser identificados como un acontecimiento clave en la carcinogénesis?
Relación entre B
[a] P
mutagenicidad y
TP53 mutaciones
Muchos metabolitos genotóxicos son producidos a partir de B
[a] P.
La forma principal, que implica CYP1A, CYP1B, CYP3A y epóxido hidrolasas, lleva a la última metabolito genotóxico (±) -anti-BPDE que se une al ADN y formas predominantemente aductos de ADN en el
N2
posición de guanina y en menor medida en el
N6
posición de adenina [23] - [25]. Otra ruta implica dihidrodiol deshidrogenasas AKR1A1 y 1C1-4 que ocasionan la oxidación B
[a] P
dihydrodiols a catecoles [26]. Catecoles pueden someterse a oxidizations mono-electrónica que conducen a
o
-quinones que formar aductos de ADN, como el B
[a] P
-7,8-dione-
N
2-DG
y el B
[a] P
-7,8-dione-
N
6
dA [27], [28]. En este estudio, durante la exposición de fibroblastos AG1521 a B
[a]
P, enzimas que metabolizan fueron suministrados exógenamente, de acuerdo con las prácticas estándar en las pruebas de genotoxicidad. El análisis post-etiquetado reveló una mancha principal que migró conjuntamente con el observado en el ADN de control expuesto a BPDE. Esto sugiere fuertemente que B
[a] P: Resultados de la exposición esencialmente en aductos de ADN. BPDE
De acuerdo con los datos en la literatura, hemos encontrado que la mayoría de las sustituciones de bases inducida por B
[a] P
se encuentra en G: C de pares de bases de los cuales sólo 6 dentro de las regiones CpG. Guanines en secuencias CpG metilados son objetivos típicos de aductos de ADN [10], [23]. Es probable que la metilación del ADN es pobre en un modelo celular tal como el empleado aquí, pero Shen
et al.
, Usando la misma cepa de levadura reportero transformada por los plásmidos modificados, observado que la metilación del ADN no afectó la generación de aductos de BPDE [21].
Uso UvrABC endonucleasa en combinación con la ligadura mediada por PCR (LMPCR), la distribución de aductos de BPDE en los exones 5, 7 y 8 de
Hoteles en TP53 Las células HeLa se han mapeado [29], [30]. la formación de aductos fuerte se produjo a las guanines en los codones 154, 156, 157, 158, 159, 245, 248 y 273, la mayor parte de los cuales se describen como puntos calientes en los cánceres de pulmón (157, 158, 245, 248 y 273; IARC base de datos, versión R14). De hecho, el codón 248 fue más frecuentemente el blanco de B
[a] P
en nuestro ensayo. En segundo lugar, el uso de metilado y BPDE-expone fragmentos de ADN que contienen el exón 5 de
TP53
, aductos se encontraron en otros tres codones: 152, 175, 181, todos los cuales fueron descubiertos en el presente estudio, así [10] .
B
[a] patrones de mutaciones inducidas
P han sido ampliamente estudiados en muchos genes en diversos sistemas biológicos. Los ensayos llevados a cabo en células de roedores
in vitro
o
in vivo
de genes indicadores tales como
HPRT
o
LacI
han reportado consistentemente el predominio de G & gt; transversiones T y, en menor medida, de G & gt; a transiciones y supresiones [31] - [34]. La tasa de G & gt; transversiones T parece ser dependiente de la concentración [31]. Curiosamente, usando un ensayo de levadura con diferentes cepas deficientes en la reparación por escisión de nucleótidos, se demostró que las ADN polimerasas η y ζ se requiere en combinación para la reparación translesion a través de aductos de BPDE, dando lugar a G & gt; T transversions [35]. Pol ζ solo también fue capaz de generar grandes deleciones en este ensayo.
Dependiendo del enfoque experimental, las discrepancias se han observado entre los patrones de mutaciones en
TP53
ha inducida por
in vitro
y
in vivo
exposición a B
[a] P o
BPDE. Utilizando el mismo ensayo de levadura como nosotros, pero después de una exposición BPDE directa de un plásmido metilado que lleva el ser humano
TP53
secuencia, Yoon
et al
han encontrado un claro predominio de G & gt;. Transversiones T mientras que Shen
et al
han encontrado principalmente G & gt;. A las transiciones [11], [21]. La secuenciación directa de
Hoteles en TP53-p53 humano knock-in (Hupki) fibroblastos embrionarios murinos después de
in vitro
exposición a B
[a] P
han mostrado principalmente G & gt ; T transversions [36], [37]. Del mismo modo, G & gt; También se encontraron mutaciones T predominantemente en los tumores de la piel después de que B
[a] P
la exposición [38]. La secuenciación de los
TP53
de varios tumores inducidos después de
in vivo
exposición de ratones a B
[a] P
o alquitrán de hulla dio lugar a la misma medida de G & gt; T , G & gt; A y G & gt; C mutaciones [39]. En conjunto, se desprende claramente de la gran mayoría de los estudios, que, independientemente del gen en estudio y el sistema biológico utilizado, G & gt; T transversión es el sello de B
[a]
P o la exposición BPDE. En este sentido, nos sorprendimos al encontrar estos transversions que representa sólo el 22% de las mutaciones en nuestro estudio, pero pasando de 17% a 1 M a 27% a 50 mM. Según lo sugerido por Wei
et al.
[31], que puede ser una cuestión de dosis. Muchos
in vitro
estudios han utilizado BPDE en el rango de M [11], [35] mientras que se utilizó B
[a] P
en el mismo rango, lo que obviamente llevó a una menor exposición a BPDE en el protocolo. Algunos
in vitro
estudios utilizaron B
[a] P
en la gama M, pero en estos estudios, el tiempo de exposición varió de 4 a 9 días en lugar de las 2 horas en nuestro protocolo [ ,,,0],36], [37]. Esto sugiere que el G & gt; T transversions podrían ser el sello de una fuerte exposición a B
[a]
P, un escenario que parece plausible en el contexto de la exposición al humo del tabaco en los fumadores pesados, mientras que la exposición moderada podría conducir tanto a G & gt; T, G & gt; a, G & gt; C y deleciones, como se encuentra en muchos estudios. Esta hipótesis está apoyada por la prevalencia de G & gt; transversiones T en los cánceres de pulmón con respecto a la exposición al tabaco. De acuerdo con la base de datos de la IARC (Figura 5), esta prevalencia oscila entre el 25% en los no fumadores y 32% en los fumadores y el 55% en los fumadores pesados
De izquierda a derecha:.
in vitro sobre B
[a] P-
fibroblastos humanos expuestos AG1521 (FASAY) (n = 37); los cánceres de pulmón humanos, no fumadores (n = 288); los cánceres humanos de pulmón, los fumadores (n = 870); los cánceres de pulmón humanos, los grandes fumadores (n = 20). El cáncer de pulmón de datos de la base de datos IARC R14. mutaciones raras se omitieron en estos patrones
A la inversa de la tasa de G & gt;. T transversión, se encontró una alta tasa de G & gt; A transiciones (38%), la mitad de los cuales se encuentra en secuencias CpG . Esto podría explicarse en parte por mutaciones espontáneas como se ve en las células control. Sin embargo, un sesgo técnico puede ser considerada desde nuestro protocolo no distinguió entre dos eventos de mutación que surjan independientemente pero idénticos y una de las siguientes situaciones: (i) múltiples transcripciones de ARNm de la misma célula mutante que son posteriormente capturados de forma independiente en plásmidos o (ii) la expansión clonal de una célula mutante antes de la cosecha de la piscina de las células tratadas. En la Tabla 2 a 3 mutaciones pueden ser potencialmente relevantes de dicho sesgo, lo que sugiere que la duplicación artefactual de las mutaciones podría ser poco frecuentes. Además, las mutaciones duplicados son en su mayoría G & gt; A transiciones en los sitios CpG. Esto puede incrementar indebidamente la velocidad de esta mutación particular.
Comparación de los
TP53
perfiles mutacionales obtenidos para el genotoxinas, B
[a] P
, acetaldehído y AFB
1 |
los resultados obtenidos de la aplicación de FASAY para evaluar los efectos mutagénicos de
in vitro
la exposición de los fibroblastos humanos normales a B
[a] P
, acetaldehído y AFB
1 se compararon. La prueba exacta de Fisher reveló que en términos del tipo de mutación, B
[a] P y
AFB
1 patrones no fueron estadísticamente diferentes (p = 0,6735), mientras que las diferencias entre las pautas de acetaldehído y o bien B
[a] P o
AFB
1 fueron estadísticamente límite de la significación (valores de p de 0,0546 y 0,0705, respectivamente). Estos tres compuestos son conocidos por causar varios tipos de daños al ADN, que podría a su vez, estar relacionados con mutaciones específicas. El acetaldehído inducida por patrón se caracteriza principalmente por una muy alta proporción de G & gt; A transiciones (66%), la mayoría se encuentra dentro de las secuencias CpG, que es una base probable para la formación de aductos de reticulación entre cadenas en secuencias CpG [15]. En contraste, la alta tasa de G & gt; T transversions observa entre B
[a] P y
AFB
1 inducida por mutaciones, ha sido reconocida como un sello distintivo de su mutagenicidad,
in vitro Opiniones y
in vivo
[4], [40]. Esto se debe principalmente a la presencia de aductos voluminosos
B
[a] P
patrón revela dos características únicas en comparación con las de la Base Aérea
1 y acetaldehído:. La aparición de G & gt ; transiciones de C y una mayor tasa de deleciones (11% vs 5-6%). Mientras que AFB
1 y deleciones de una sola base de acetaldehído inducido, B
[a] P
podría generar supresiones de hasta 24 nucleótidos. Esta característica puede ser el resultado de una vía de síntesis de translesion particular de B
[a] P
aductos como se discutió anteriormente.
Por lo tanto, un análisis preliminar usando el FASAY nos permitió registrar y distinguir diferentes experimentalmente patrones de mutación generada en
TP53
, que luego se utiliza para comparar con los datos epidemiológicos existentes en los mapas de aductos de ADN y mutaciones tumorales en
TP53
.
la aparición de experimentación
TP53
mutantes en tumores humanos y el impacto funcional de las mutaciones
La distribución agrupada de codones mutados obtenidos después de la exposición a cada uno de los tres genotoxinas discutidos aquí nos ha permitido identificar importantes 6-puntos calientes en humanos tumores, los codones 248, 273, 175, 245, 282, 249 (Figura 4).
a nivel fenotípico, entre los 63 mutantes que resultan de una sustitución de nucleótidos, los dos más frecuentes recuperado en tumores humanos eran también encontrado en nuestros modelos experimentales, es decir Arg175His y Arg248Gln (Tabla 3). Por otra parte, cuatro sustituciones (Arg175His, Arg248Gln, Arg273Cys y Gly245Ser) representan a más de 10% de los mutantes que se encuentran en los tumores humanos. Sólo tres mutantes se encuentran en nuestro estudio nunca se han descrito en los tumores humanos (Gly117Val, Gly262Leu, Asn288Ile). Esto sugiere fuertemente que FASAY recupera mutantes que llevan un cambio funcional que permite la selección durante el proceso de la carcinogénesis.
Se evaluó la consecuencia funcional de las mutaciones se producen después de
in vitro
la exposición a sustancias químicas en el tres la luz de los datos de Escasez
et al.
que examinó el impacto de 76
TP53
mutantes observa con frecuencia en los tumores humanos [12]. Catorce de los 76 mutantes analizados fueron recuperados en nuestros tres modelos experimentales (Tabla 3). Como era de esperar, estos 14 mutantes carecían de actividad en
RGC
secuencias que se utilizó en nuestro protocolo FASAY. Este análisis indica que la mayoría de las mutaciones experimentales albergan deterioro funcional importante, es decir, pérdida completa de la actividad transcripcional en 22 p53 de ADN secuencias de unión (DBS) y el efecto negativo dominante (DNE). Por el contrario, algunas de las mutaciones que son frecuentes en tumores humanos es poco probable que ser recuperada por el FASAY ya que conservan la actividad transcripcional [12]. Esto incluye, por ejemplo, Arg175Leu o Glu285Lys que no se encuentra en nuestro ensayo.
Sin embargo, el análisis funcional de los mutantes por FASAY no nos permite discriminar entre diferentes tipos de cánceres. De hecho, si nos permite FASAY consultamos los mutantes que aparecen con frecuencia en los tumores humanos, estos mutantes eran ni muy frecuentes ni poco frecuente en los tumores relacionados con la exposición a un genotoxin particular. Por ejemplo, Arg175His y Arg248Gln conocer en B
[a] P y
AFB
1 patrones son los mutantes identificados con mayor frecuencia en los tumores humanos, que representan el 4,25% y el 3,21% de todos los mutantes, respectivamente (Tabla 3), pero representan sólo el 1,2% de los cánceres de pulmón o mutantes de hepatocarcinoma según la base de datos de la IARC. De la misma manera, Arg273Cys representadas en el patrón de acetaldehído es más frecuente en todo el espectro de tumores humanos (2,44%) que en que para el cáncer de esófago (1,3%).
Este análisis pone de manifiesto la capacidad de los productos químicos para inducir frecuente y altamente deteriorado
TP53
mutantes que pueden ser un evento clave que participan en la carcinogénesis. En comparación con los ensayos de mutagénesis clásica utilizando genes indicadores, este
in vitro
enfoque funcional ofrece sólidos argumentos para una plausibilidad biológica de carcinogenicidad para un genotoxin. No obstante se recapitula sólo el paso de la iniciación de la carcinogénesis y en consecuencia es inexacta en particular, predecir qué mutación podría ser una fuerza impulsora durante las etapas posteriores de la carcinogénesis en un determinado tejido.